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MONITORAMENTO AMBIENTAL EM BIOTÉRIO CONVENCIONAL: O USO DO VAPORIZADOR COMO UM EQUIPAMENTO ALTERNATIVO DE BARREIRA SANITÁRIA

RESUMO

O objetivo desta pesquisa é validar o uso do vaporizador: aparelho que atua com água sobre alta pressão e temperatura, como um equipamento alternativo de barreira sanitária em biotérios de status convencional. Para isso foi realizada uma análise comparativa dos procedimentos de desinfecção e esterilização, métodos-padrão utilizados nos atuais laboratórios de pesquisa e ensaio; adicionalmente foi realizada a mensuração do nível de crescimento de fungos e bactérias nas gaiolas de roedores do Centro de Referência de Criação de Camundongos no Centro de Ciência da Saúde/UFRJ. Foram realizados cinco tratamentos nas gaiolas, descriminados em: grupo A (gaiolas desinfetadas a 1% de hipoclorito); grupo B (gaiolas desinfetadas com hipoclorito a 1% e vaporizadas); grupo C (gaiolas desinfetadas com hipoclorito a 1% e autoclavadas –  controle-positivo); grupo D (gaiolas sujas– controle negativo) e grupo E (gaiolas do grupo D imersas no hipoclorito a 1% em um curto período de tempo). Através de métodos de cultivo convencionais e referência foi avaliado o crescimento de fungos e bactérias nestas gaiolas. Após a análise dos resultados obtidos, foi concluído que, com uma barreira sanitária química eficiente (hipoclorito a 1%) e tempo adequado, a atuação do vaporizador, aliada a um bom sistema de monitoramento ambiental, consegue-se reduzir significativamente o crescimento desses microrganismos no ambiente, e a autoclave pode, possivelmente, ser substituída na rotina sanitária do biotério. Portanto, esta pesquisa abre um viés para investigações mais específicas na linha do monitoramento ambiental, em biotérios de status convencional.

Palavras-Chaves: Animais de laboratório; Esterilização e Desinfecção; Método alternativo

ABSTRACT

The objective of this research was to validate the use of the vaporizer: an apparatus that with water at high pressure and temperature, as alternative equipmentsanitary barrier in conventional status animal facilities. For this, a comparative analysis of the disinfection and sterilization procedures, standard methods used in the current research and testing laboratories was performed; additionally, the measurement of the level of pathogenic loads in the rodent cages from the Reference Center of Mice Creation in “Health Sciences Center/UFRJ” was carried out. Five treatments were carried out in the cages, described in: group A (cages disinfected with 1% hypochlorite); group B (disinfected cages with 1% hypochlorite and vaporized); group C (disinfected cages with 1% hypochlorite and autoclaved – control positive); group D (negative control cages) and group E (group C cages immersed in 1% hypochlorite in a shorter period of time). Through conventional and reference cultivation methods, the fungi and bacterial pathogenic charge on there cages were evaluated. After analyzing the obtained results, it was concluded that, with efficient chemical health barrier (1% hypochlorite) and adequate period of time, the performance of the vaporizer, coupled with a good environmental monitoring system, can significantly reduces the growth of bacteria and fungi, and the autoclave may possibly be replaced in the sanitary routine of the vivarium. Therefore, this research opens a spece for more specific investigations in the line of environmental monitoring, in conventional status biotery.

KEYWORDS: Laboratory animals; Disinfection and sterilization; Alternative methods

INTRODUÇÃO

A maioria das pesquisas biomédicas para ter credibilidade em seus resultados, depende do animal de laboratório como biomodelo experimental, pessoal qualificado, boas práticas e equipamentos de precisão. Todos esses fatores devem estar adequados e preparados para responder aos experimentos das variadas modalidades de investigações científicas (MARX et al.,2017).                  

No Brasil, com o avanço da biotecnologia e o intercâmbio com outros países, o bioterismo alcançou, nessas últimas décadas, um patamar de alta qualidade em animais, equipamentos e insumos, nas instituições biomédicas que executam a pesquisa básica e aplicada. Contudo, a maioria dos biotérios brasileiros é de “status sanitário convencional controlado”, por serem menos dispendiosos, se comparados aos biotérios de status sanitário mais sofisticados e complexos, como os Axênicos ou Germ Free (estéreis) e SPF – livres de germes patogênicos específicos (GILIOLI, 2003).

            Convém salientar, que esses biotérios, mesmo sendo de status convencional controlado necessitam também do equipamento de referência em esterilização – a autoclave – para manter o monitoramento microbiológico do ambiente e dos animais em equilíbrio. Entretanto, há um viés negativo no que concerne ao orçamento dos biotérios que mantém a autoclave como padrão de barreira sanitária (LAPCHIK et al., 2009). Ele é um equipamento muito dispendioso, tanto no seu valor de compra, quanto em sua manutenção.

            Por esse motivo, é preciso criar estratégias de controle microbiológico em biotérios convencionais, que venham a minimizar cada vez mais as contaminações por microrganismos nas instalações e, consequentemente, no animal de laboratório. Com o uso de detergentes corretos, uma temperatura de 80°C e um bom monitoramento ambiental, “a carga de patógeno de animais de laboratório pode ser reduzida”, sendo desnecessário o uso da autoclave em biotérios convencionais (COMPTON, MACY, 2015).

            A importância do monitoramento ambiental e a validação desses equipamentos alternativos de barreira sanitária, de baixo custo, que sejam eficientes na redução de microrganismos será um grande passo para a economia de verbas desses biotérios e manutenção do nível de qualidade do status sanitário do animal de laboratório. Porque, mesmo os biotérios com rígidos programas de controle sanitário, ainda assim, continuam vulneráveis a contaminações e deverão ser monitorados periodicamente (MCINNES et al., 2012).

OBJETIVO

GERAL: Testar o vaporizador como um equipamento alternativo de barreira sanitária em biotérios de status convencional controlado.

ESPECÍFICO:

  • Mensurar o nível de contaminação por bactérias e fungos em gaiolas de roedores, após a ação do vaporizador;
  • Comparar a quantidade de colônias de bactérias e fungos resistentes nas gaiolas que foram desinfetadas e vaporizadas com as gaiolas que foram unicamente desinfetadas e esterilizadas;
  • Validar o vaporizador como equipamento alternativo, caso a sua eficiência, na redução desses microrganismos, seja significativa;
  • Estabelecer o uso do vaporizador como barreira sanitária na rotina de pequenos biotérios de status convencional.

MATERIAL E MÉTODOS

            A pesquisa teve como foco principal a análise microbiológica das gaiolas de roedores e do macroambiente do biotério, a fim de permitir elaborar uma rotina de monitoramento ambiental, utilizando o vaporizador como equipamento alternativo de barreira sanitária. Os estudos foram realizados no Centro de Referência e Criação de Camundongos para Pesquisas Científicas e no Laboratório de Controle Microbiológico de Medicamentos, Alimentos e Cosméticos (LACMAC), ambos localizados no Centro de Ciências da Saúde (CCS) da Universidade Federal do Rio de Janeiro – UFRJ.

Gaiola de camundongos isogênicos (foto do autor)

O biotério do Centro de Referência e Criação de Camundongos enquadra-se na classificação, quanto ao status sanitário, como sendo biotério convencional controlado, onde a produção animal destina-se ao atendimento determinado pela demanda das pesquisas que utilizam animais de laboratório no Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal do Rio de Janeiro. A metodologia da pesquisa foi desenvolvida com o uso de gaiolas de roedores classificadas em cinco grupos (grupos: A, B, C, D e E). Cada grupo composto de três gaiolas descriminadas da seguinte forma:

  • Grupo A: gaiolas que foram desinfetadas com hipoclorito a 1%;
  • Grupo B: gaiolas desinfetadas com hipoclorito a 1% e vaporizadas;
  • Grupo C: gaiolas desinfetadas com hipoclorito a 1% e autoclavadas (grupo controle positivo, considerando a autoclavação como a metodologia padrão);
  • Grupo D: gaiolas sujas (controle negativo);
  • Grupo E: gaiolas do grupo D imersas no hipoclorito por 2 minutos).             

            Para conectar a mangueira de vapor, abre-se a tampa do bocal da mangueira, direciona-se os guias existentes, tanto na mangueira de vapor quanto no local do equipamento. Pressiona-se até ouvir um “clique” . Para abastecer com água, retira-se a tampa de segurança da caldeira, girando-a sempre no sentido anti-horário . Abastece-se a caldeira do vaporizador com um volume máximo de dois litros de água potável, usando a jarra escalonada e o funil .

Autor vaporizando as gaiolas de camudongos

            Em seguida, coloca-se a tampa de segurança, girando-a sempre no sentido anti-horário . Conecta-se o plugue na tomada e liga-se o vaporizador, acionando o interruptor LIGA/DESLIGA . Ao ser acionado, o interruptor acenderá o LED: liga/desliga. Deixa-se o equipamento aquecer por aproximadamente dez minutos. Completados os dez minutos, o LED, indicador de vapor, acenderá. Gira-se o regulador de vapor no sentido horário da seta, para obter-se maior vazão de vapor ).

Nota: nos procedimentos, a marca Wapore Clean, foi escolhida porque tem uma temperatura máxima de 98o Celsius, que condiz com a estabelecida na literatura de monitoramento ambiental de biotérios.

            Todos os experimentos realizados seguiram os protocolos (POP) exigidos, e as condições que padronizam, definem e estabelecem a estrutura funcional do biotério. Essas regras são aplicadas a todos os funcionários envolvidos nas atividades de rotina, executadas na área de higienização, esterilização e manejo do biotério do Centro de Ciência da Saúde/ UFRJ.

A higienização e o controle microbiológico da gaiola são muito importantes, porque no seu interior –  o microambiente –  é mantida a “cama”, onde o animal vive e se reproduz. Além disso, ela tem a função de absorver a urina, aquecê-los e servir de ninho para manter os filhotes, não obstante, a “cama” seja uma das maiores fontes de contaminação (através da própria urina e fezes).

            A estrutura dessas gaiolas deve ser em plásticos (Polisulfona), resistentes a repetidas autoclavagens; filtro superior lavável e de fácil substituição, sem a necessidade do uso de ferramentas e com travas de segurança que evitam abertura acidental. O formato e dimensões padronizados: 21 cm de altura x 32 cm de comprimento x 20 cm de largura, e forma retangular.

            As gaiolas sujas são empilhadas em grupos de quinze unidades e em seguida, higienizadas em dois tanques de imersão: no tanque nº1, as gaiolas foram lavadas com água e detergente neutro uma a uma, em seguida, desinfetadas no tanque n°2 com hipoclorito a 1%. As gaiolas higienizadas são colocadas horizontalmente no tanque de imersão nº 2 de forma que todas as superfícies (internas e externas) estejam submersas e permanecerá num período de 30 minutos.

            Logo após o período de imersão no hipoclorito a 1%, as gaiolas são retiradas e secadas para serem esterilizadas na autoclave num período de 20 minutos.

            O ambiente de realização da coleta das amostras foi a área de esterilização e desinfecção de matérias do biotério, e o procedimento foi feito da seguinte forma:

  • Foram utilizadas nove gaiolas e todas elas desinfetadas no tanque de imersão com hipoclorito na concentração de 1%;

                Após a desinfecção com hipoclorito a 1% foram divididas em 5 grupos (A, B, C, D e E), cada grupo com três gaiolas;

    Grupo A:  três gaiolas desinfetadas com hipoclorito a 1% em um período de 30 minutos, secas com pano estéril, em seguida feita a coleta de material (com o swab estéril) em três pontos da gaiola: nos cantos, fundo e paredes;

  • Grupo B: as três gaiolas desinfetadas com hipoclorito a 1% em um período de 30 minutos, secas com pano estéril e vaporizadas, secas com pano estéril novamente e coleta do material nos cantos, fundo e paredes (com swab estéril);

● Grupo C (Controle positivo): desinfetadas com hipoclorito a 1% em um período de 30 minutos, autoclavadas e coleta do material, nos cantos, fundo e paredes, (com swabs estéril).

  • Grupo D (Controle negativo): gaiolas sujas. Foram coletados com swabs estéreis os três pontos (canto, fundo e parede);
  • Grupo E: as mesmas gaiolas do grupo D foram imersas no hipoclorito a 1% no período de 2 minutos e realizada a coleta com swabs estéreis, nos respectivos ponto, cantos, fundo e paredes.

  

Antes de iniciar a análise, foi registrada a entrada da amostra, de acordo com a LACMAC – IT – 0002, em sua versão vigente. Esta numeração é sequencial numérica (3 dígitos) e é reiniciada a cada ano. Por exemplo: XXX/YY. Onde XXX é sequencial numérico e YY final de cada ano.

  • Preparo da Amostra (Protocolo do LACMAC/UFRJ, 2018)

            No preparo da amostra (diluição inicial 1:10) podem ser usados como soluções diluentes: caldo cloreto de sódio peptona pH 7.0 ou caldo caseína-soja (Caldo Casoy). Preparar diluições decimais sucessivas, com o mesmo diluente, se necessário.

            Para amostras solúveis em água transfere-se 10 g ou 10 ml da amostra para frasco contendo 90 ml da solução diluente. Já as amostras gordurosas seguem o mesmo procedimento acrescendo 5% de polissorbato 20 ou 80 estéril. Se necessário, aquecer o frasco em banho-maria a 450 Celsius, até a  completa dissolução da amostra.

  • Contagem em Placas / Método de Profunidade Pour Plate (Protocolo do LACMAC/UFRJ, 2018)

            Com pipeta estéril, transfere-se alíquotas de 1 ml da diluição para quatro placas de Petri. Em duas placas, adicionar cuidadosamente cerca de 20 ml de ágar caseína-soja (meio para contagem de bactérias) e às outras duas, adicionar cerca de 20 ml de ágar sabouraud dextrose ou ágar batata dextrose e 0,3 ml de ácido tartárico a 10% e as temperaturas dos meios de culturas devem estar no máximo a 45o Celsius. Logo após este procedimento, homogeneizar o conteúdo das placas, realizando movimentos suaves e circulares, em forma de oito. Após a solidificação do ágar, inverte-se as placas e incubar em estufa nas seguintes condições:

  • Ágar caseína-soja (TSA): 32,5o Celsius, 24 h e até 48 horas.
  • Ágar sabouraud dextrose ou ágar batata dextrose (BDA): 22,5o Celsius durante 5    a 7 dias.

            Como controle de esterilidade dos meios, verter em placas de Petri cerca de 20 ml de cada um dos meios utilizados nas análises e, após a solidificação do ágar, incubá-las nas mesmas condições descritas para as amostras.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Resultados dos cinco experimentos realizados nas gaiolas de roedores

A pesquisa foi limitada a análise de crescimento de bactérias e fungos em cinco grupos de gaiolas de roedores de laboratório, através do método de plaqueamento em Ágar caseína-soja (TSA) e Ágar sabouraud dextrose ou ágar batata dextrose (BDA).

             O Teste de Sensibilidade aos Antimicrobianos (TSA), representa uma importante ferramenta no monitoramento da evolução de resistência bacteriana e age, também, como um método auxiliar na implantação de medidas de controle que pode evitar a disseminação de bactérias multirresistentes no ambiente (CLSI-EUA, 2016).

             Não obstante, o trabalho abre precedente à continuação de maiores investigações na área da Microbiologia, para uma possível validação do vaporizador como um equipamento alternativo e estratégico de barreira sanitária no monitoramento ambiental, tanto no biotério do Centro de Referência de Criação de Camundongos do CCS/UFRJ, quanto em outros biotérios do mesmo status sanitário.

            Para que o vaporizador futuramente seja validado é necessário seguir os padrões exigidos pela Coordenação Geral de Acreditação (DOQ-CGCRE-008, 2016) e, caso se enquadre nas suas normas de validação, ele poderá ser inserido no grupo de “Ampliação e Modificação de Métodos Normatizados”. Além disso, será necessário um maior aprofundamento no tocante a análise dos variados métodos microbiológicos, tais como: prova da catalase, extrações de DNA e PCR, para dar um maior embasamento nesse método alternativo de monitoramento ambiental.

CONCLUSÃO

Com base nos resultados das análises microbiológicas obtidas nos experimentos I, II, III, IV e V realizados no Centro de Referência de Criação de Camundongos Inbreed e outbreed  e no Laboratório de Controle de Qualidade de Medicamentos e Alimentos (LACMAC) ambos no CCS/UFRJ conclui-se que, na rotina desse biotério de status sanitário convencional controlado, com um monitoramento ambiental eficiente utilizando as barreiras sanitárias: química – com hipoclorito a 1% (período de 30 minutos)  e física, com o vaporizador a 20 cm de distância das gaiolas de roedores (num período de 1 minuto), reduz consideravelmente o crescimento de bactérias e fungos nas gaiolas de animais de laboratório fazendo com que a autoclave, equipamento de referência em esterilização, possivelmente seja  substituída na rotina sanitária do biotério e, principalmente, haja menor gasto em seu orçamento.

            Portanto, para que esse método seja validado, sugere-se dar maior aprofundamento à pesquisa e testar em outros biotérios, do mesmo status sanitário, se a eficiência deste método alternativo de barreira sanitária e do monitoramento ambiental é funcional.

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